Effect of drugs of abuse on CNS HIV-1 reservoirs and neuropathogenesis

Project summary    The long term goal of this application is to study HIV-­1 reservoirs that persist in CNS and to understand  the role of illicit drugs in establishing and reactivating the latent reservoirs. Persistence of latently infected cells  in CNS poses a major barrier for HIV-­1 eradication. Current strategies to eliminate the latent reservoirs include  a  ?shock  and  kill?  therapy  and  is  aimed  at  peripheral  blood,  which  constitutes  only  1%  of  the  total  reservoirs.  Whether  it  is  possible  to  envision  similar  strategies  for  the  eradication  of  HIV-­infected  CNS  cells  is  currently  unknown.  In  addition  to  the  lack  of  knowledge  about  latency  in  CNS  HIV+  cells  and  the  effects  of  latency  reversing agents, illicit drugs common within the HIV-­infected populations constitute a further complexity. Many  illicit drugs are known to stimulate HIV-­1 replication. Since the current method to measure the peripheral blood  HIV reservoir is not applicable to solid tissues or to cells that replicate poorly such as macrophages, microglia  and  astrocytes  found  in  the  brain.  We  have  developed  a  novel,  Single  cell-­single  molecule,  Multiplex,  Immunofluorescence  (IF)  and  RNA  FISH-­based  Assay  (SMIRA)  to  detect  cells  in  which  HIV-­1  is  actively  replicating.  Using  automation,  a  large  number  of  cells  can  be  scanned.  In  this  proposal,  we  will  employ  this  novel method to first quantitate and characterize latency in cell line models, then the latent reservoirs in brain  derived microglia and astrocytes and delineate the effect of three drugs of abuse (methamphetamine, cocaine  and  cannabis)  on  the  efficiency  of  formation  of  latent  cells,  the  rate  of  reactivation  of  latent  cells,  and  establishment of latency across blood-­brain-­barrier (BBB). Three Aims are proposed. In Aim 1,  we will study  the role of illicit drugs on the reactivation of latently infected CNS-­derived cells by establishing in vitro and ex  vivo  models  of  latency.  First,  we  will  employ  immortalized  human  monocyte  and  microglial  cell  lines  to  study  the  kinetics  of  reactivation  and  the  effect  of  METH,  Cocaine  and  cannabis  on  the  reactivation  using  SMIRA.  This will be followed by similar studies using a primary CNS cells. In Aim 2, we will study the role of illicit drugs  on the establishment of HIV reservoirs in CNS cells across BBB. Using SMIRA to detect HIV-­1+ cells, we will  determine  the  relative  effect  of  drugs  of  abuse,  antiretrovirals  and  the  addition  of  LRAs  to  establish  latency  across BBB. In Aim 3, we will study the effect of illicit drugs on CNS HIV reservoirs in HIV-­infected individuals.  Employing  brain  autopsy  samples  from  HIV+  individuals  with  or  without  illicit  drug  use  history  (from  the  Manhattan Brain Bank (NNTC), we will characterize the relative frequency of microglial and astrocyte latent cell  reservoirs  in  which  HIV-­1  is  actively  replicating  vs.  those  that  are  latent,  using  SMIRA  and  state-­of-­the-­art,  high-­speed/resolution whole slide scanner, the PerkinElmer Pannoramic 250 Flash II. We will study the effect  of  drug  abuse  on  the  rates  of  reactivation.  The  proposed  studies  will  provide  valuable  tools  to  study  establishment and reactivation of CNS latency in response to illicit drugs and provides a drug screening assay  to eradicate these latent cells in the future.